斑馬魚技術在各領域中的應用

一、斑馬魚在基礎研究領域的應用、基因功能研究、疾病發病機制研究等

1、發育生物學:斑馬魚可應用于發育生物學的器官發育研究、細胞譜系分析、突變鑒別、飽和誘變分析、基因轉移研究、基因連鎖圖的構建,其體外受精、胚體透明、細胞分裂快等特點使它比起大小鼠有獨特優勢。


2、基因功能研究:斑馬魚繁殖速度快,能提供足夠量的胚胎用于基因篩選;其胚體透明的特點可以一目了然地觀察到基因突變后的表型變化,進而揭示出基因的生理功能。


3、疾病發病機制研究:斑馬魚的器官發生、疾病生理、基因組與人類相似度較大,主要信號通路和基因具高度同源性,諸多斑馬魚疾病(如血癌、免疫性系統疾病、感染疾病等)模型已建立,利用斑馬魚的疾病模型來研究治愈人類相關疾病是近年全球熱點的科研項目。

二、斑馬魚在藥物篩選與研究評價中的應用

斑馬魚模型既具有體外實驗快速、高效、費用低等優勢,又具有哺乳類動物實驗預測性強、可比度高等優點,可以有效彌補體外實驗和哺乳類動物實驗之間的巨大生物學斷層,完善現有藥物研發體系。將斑馬魚模型魚體外實驗和哺乳動物實驗相結合,可以從整體上縮短藥物臨床前早期研發的實驗周期,降低實驗成本,提高實驗預測的準確性,進而提高藥物研發效率,降低藥物研發風險。

全球醫藥巨頭輝瑞、羅氏、諾華、葛蘭素史克、阿斯利康等都逐漸開始使用斑馬魚技術進行藥物篩選研發。2009年,斑馬魚藥物毒理學評價技術首次通過FDA和EMA的GLP認證,這標志著斑馬魚模型的安全藥理學和毒理學評價結果可以作為正式材料納入臨床試驗申報資料。2013年,斑馬魚資料首次用于中國新藥臨床申報,目前,中國使用斑馬魚實驗數據申報CFDA臨床試驗批件的新藥研發項目已經有10項,4項已經獲得批件。美國食品藥品監督管理局(FDA)越來越多地應用斑馬魚對臨床前藥物進行安全性與毒理性評價。在中藥領域,斑馬魚廣泛應用于中藥藥效評價、活性成分篩選、安全毒理學研究、生物學質量控制研究及應用等多個方面,并先后列入多個國家重大新藥創制課題。天士力醫藥集團、民生藥業、步長制藥、北京中醫藥大學、中國中醫科學院、中國食品藥品鑒定研究院等單位先后發表了多篇用斑馬魚進行中藥質量研究的文章。


三、斑馬魚在營養保健食品研發中的應用

斑馬魚在藥物特別是在中藥和天然藥物研究領域的廣泛應用,也為斑馬魚在營養保健食品行業的應用奠定了堅實的基礎。斑馬魚在營養保健行業的應用也日益廣泛,湯臣倍健、無限極、養生堂、安利紐崔萊、康寶萊、完美中國、玫琳凱等國內營養保健食品行業前20的企業都已將斑馬魚用于營養保健食品的研發,除了原料篩選和配方評價,還用于產品作用機制研究和已上市產品的二次開發和營銷。


經張伯禮院士、孫寶國院士、吳清平院士領銜的技術專家評審,斑馬魚產業化項目成果鑒定,分獲“國內領先水平”和“國際先進水平”?!栋唏R魚功效與安全性快速評價系統在健康食品中的應用》產業化項目獲得了2020年度“無限創新”江門科學技術獎一等獎和中國食品科學技術學會科技創新技術進步獎三等獎。中國保健協會于2021年7月17日在北京組織相關領域專家召開了“斑馬魚技術應用研討會”,邀請張伯禮院士、鄭守增教授等中醫藥和營養保健食品領域的30多位專家和企業代表對斑馬魚技術在營養保健食品行業的推廣應用進行了研討,與會專家高度認可斑馬魚在營養保健食品研發中的應用價值,并強烈建議進一步加強斑馬魚技術的標準化建設工作,以期后續將斑馬魚應用在除產品研發之外的更多領域。

2020年6月,環特生物聯合養生堂、無限極、完美(中國)、壽仙谷等十多家單位在國內首次發布了抗氧化和潤腸通便2項保健食品功能評價技術方法團體標準。2022年4月,環特生物聯合中國標準化研究院、農業農村部食物與營養發展研究所、中國疾控中心營養所權威機構和10多家行業龍頭企業發布了《保健食品功能評價 斑馬魚試驗規程》團體標準。在環特的示范和帶領下,越來越多的機構開始啟動斑馬魚技術標準的制訂工作。這一系列標準的制訂和發布為斑馬魚在保健食品功能評價方面的應用打下了堅實基礎。

表1. 基于斑馬魚技術的保健食品評價技術標準


四、斑馬魚在化妝品研發中的應用

斑馬魚屬于非哺乳類脊椎動物,在實驗動物倫理方面的限制小。歐盟關于動物實驗的相關指令《Council Directive 2010/63/EU》規定自主進食之前的魚類可不受動物實驗限制(受精后5天以內的斑馬魚胚胎和幼魚)。使用斑馬魚進行化妝品研究和評價符合動物福利保護的國際“3R”原則。

大量的研究成果證實了斑馬魚與人類的皮膚結構和功能高度相似、皮膚相關生物信號傳導相似、受試物的暴露和吸收方式的相似性,這為斑馬魚可用于化妝品研究和評價奠定了扎實的科學基礎。國際上早在1990年代就開始用斑馬魚作為實驗模型進行黑色素形成機制、皮膚傷口炎癥反應與愈合機理、皮膚色素沉著機理及修護方法等方面的皮膚科學研究以及化妝品開發研究。此外,斑馬魚實驗結果通常展現的是整體的宏觀形態學特征,在顯微鏡下可以觀察到斑馬魚皮膚的生理變化情況,因而可實現直觀形象的測評結果展示。下圖展示的斑馬魚評價黑色素形成抑制的效果圖。


隨著《化妝品監督管理條例》的頒布和實施,斑馬魚在化妝品產品和原料開發中的應用價值正得到越來越多機構的認可。斑馬魚技術可以滿足普通化妝品部分功效檢測的需求,在人體功效實驗的前期進行篩選,降低后期實驗成本和壓力,縮短試驗周期。此外,從研發維度來說,斑馬魚技術可提供功效機制或機理方面的技術支持,完善了現有的化妝品研發技術體系,可與細胞模型、動物模型等進行配合和互補。

為了推動斑馬魚技術在化妝品行業的應用,環特生物一方面對外輸出技術,協助云南貝泰妮、 廣州嬌蘭、養生堂等化妝品行業頭部企業建立了斑馬魚實驗室;另一方面加快化妝品評價的斑馬魚技術方法標準建設工作,目前正式發布的化妝品功效評價斑馬魚實驗方法團體標準已經有10多項,還有一系列方法標準正在制訂之中。表2是目前斑馬魚技術在化妝品領域應用中已發布的團體標準。

表2. 化妝品評價的斑馬魚技術方法團體標準


五、斑馬魚在環境檢測與化學品風險評估中的應用

斑馬魚早在1930年左右就已經在歐洲用于環境監測。截至2021年底,OECD和ISO等國際機構頒布的使用斑馬魚進行水質、化學品、納米材料和環境毒理學評價的魚類實驗指導原則和標準已經有14項。2007年,美國環境保護署(EPA)啟動了旨在用高通量技術評估和研究化合物毒性的ToxCastTM項目,開展了一系列斑馬魚實驗方法的開發,美國國立衛生研究院(NIH)和美國食品藥品監督管理局(FDA)都加入了該項目。中國也已經等同轉化了其中的大部分標準。詳見表3。

表3. 國內外部分斑馬魚技術相關標準方法


近十幾年來,隨著轉基因技術的發展和應用,轉基因斑馬魚也逐漸應用于水質監測,其對污染物的作用反應快,可在短時間內調查水污染狀況或用于特定污染物的檢測。將目標質粒注射到斑馬魚體內,斑馬魚經過篩選得到穩定的轉基因品系,通過觀察熒光蛋白可以用來快速檢測不同的環境污染物。下圖所示,轉基因斑馬魚接觸雌激素肝臟部位發出綠色熒光。

 

此外,可以觀察斑馬魚幼魚特定基因被人為修飾后對環境污染物的毒性效應差異,進而快速驗證環境污染物的毒性分子機制(瞬時表達調控)。下圖所示案例中,通過敲降或過表達six7基因來研究PBDEs視覺毒性效應的機制。

六、總結

斑馬魚作為一種小型脊椎類模式生物,很好地彌補了傳統體外細胞學等生物檢測方法與哺乳動物實驗檢測中間的生物學鴻溝,有助于將體外實驗結果更好與體內實驗結果相結合,提高科學研究的效率和質量。同時,斑馬魚自身獨特的生物學特征,也為我們探究和深入理解人體生命奧秘帶了極大的便利。相信隨著更多新技術、新方法的出現以及相互融合,斑馬魚在生命科學研究、醫藥研發、營養保健食品研發、化妝品檢測與評價以及環境毒理學等多個領域發揮更大的作用。


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